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液体培养基其能有效地提高白芨种子萌发率
      
  白芨[Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.]为兰科(Orchidaceae)白芨属(Bletilla Reichb.f.)多年生宿根草本植物,根呈白色,数个相连,故名白芨,别名白及、连及草、甘根。白芨花大色艳,具有较高的观赏价值;同时白芨生有肥厚的肉质块状假鳞茎,是重要的中药材之一,具有收敛止血、消肿生肌的功效。随着白芨的持续开发,市场需求连年增长,价格逐渐上涨,致使野生资源私挖滥采严重,导致白芨野生资源濒临枯竭,现有的白芨资源受到严重破坏,已无法满足市场需求,因而也被国家列为重点保护野生药用植物之一。
  在自然野生状态下,成熟的白芨种子呈粉末状,非常细小,开花授粉15周后的种子有胚率仅为59%左右,很少萌发成苗,因此其种子自然萌发率极低,繁殖困难。目前人工繁育多采用分株繁殖,即将块茎切成小块种植,但繁殖系数低、消耗量大、大面积供种依然较为困难,难以满足大规模生产的需求。采取植物组织培养技术,可在短时间内获得大量的白芨实生苗,是一种快速有效的繁殖方法,目前主要通过将种子撒播在添加激素的固体培养基上萌发,再生出无菌苗,或诱导原球茎、经增殖生根后进行快繁,这要涉及4~5种以上的培养基,操作较为繁琐,且周期较长,最短在110 d内方能成苗移栽,相对生产成本较高。为此课题组探讨了一种基于液体培养基的白芨种苗离体快繁技术,
  该技术选用液体培养基,用液体悬浮培养萌发种子,而不是常用的固体培养基表面萌发,其能有效地提高白芨种子萌发率,缩短白芨成苗时间,快速获得白芨幼苗,下面将该技术介绍如下。
  1 未成熟白芨种子离体培养
  1.1 种子表面灭菌及萌发
  选取开花授粉15周后、未开裂的白芨蒴果(含种子),在成都农业科技職业学院园林园艺分院实验室超净工作台上用75%乙醇进行表面消毒30 s,去离子水冲洗1~2次。用解剖刀及镊子仔细剥开果实,将种子小心地抖落到无菌组织培养瓶中,加适量5%的次氯酸钠溶液(滴加1~2滴吐温-20)消毒20 min。用灭菌的50目细胞筛过滤种子;再用去离子水冲洗、过滤,反复4~6次,冲去表面残留的消毒液。将细胞筛上过滤的种子以MS+1.0 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的种子萌发液体培养基冲洗到三角瓶内,于25 ℃、100 r/min黑暗培养15-20 d。通常培养5 d后,种子即可萌发,此时转入16 h/8 h的光周期环境下光照培养,一般接种15 d后种子发育形成叶片。
  1.2 种子生长成芽
  将接种15 d、已萌发的白芨种子经50目细胞筛滤去液体,把种子原球茎接种于MS+0.2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂、pH 5.8的固体诱导成芽培养基上,尽量分散幼苗,每皿约100粒,于25 ℃、16 h/8 h光周期培养。一般培养30 d后,当幼芽生长为幼苗,约2 cm左右、根长约0.5 cm左右时即可进行生根培养。
  1.3 生根培养
  将平皿中的白芨幼苗接种到1/2 MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+2 g/L活性炭+6 g/L琼脂、pH 5.8的固体生根培养基上,每瓶接种25~30株,于25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养,促进幼苗和根的生长,提高壮苗生根率。生根培养30 d后,组培苗生长为健壮的成苗,形态见图1。
  1.4 炼苗移栽
  当白芨幼苗的根生长到3~5 cm时(一般在白芨种子萌发后75-90 d)即可炼苗移栽,栽前先逐渐揭开瓶盖适应3-5 d外界环境,期间注意保持瓶内湿度。移栽时用清水洗净根部琼脂,避免损伤根及原球茎;将健壮的白芨组培苗移栽到装好育苗基质的穴盘中,选蔬菜或花卉育苗基质即可,栽后基质浇透水,于炼苗棚中培养。棚中前期注意弱光保湿,第一周应覆盖遮阳网保持弱光,并覆盖薄膜保湿;移栽15 d后白芨成苗即生长正常,移栽30 d左右即可定植,定植后常规田间管理,移栽情况见图2。白芨移栽存活的关键是原球茎的大小及活力,一般有原球茎的幼苗均能移栽存活,存活率可达95%以上。
  2 近成熟白芨種子离体培养
  2.1 种子表面灭菌及萌发
  将开花后20周以上、近成熟的白芨蒴果(未开裂,含种子)用纱布包好,自来水流水冲洗30 min,再在超净工作台上用75%乙醇进行表面消毒30 s,无菌水冲洗1~2次,用解剖刀及镊子小心剥开果实,将种子小心拨入无菌组培瓶中,加适量5%次氯酸钠溶液(滴加2~3滴吐温-20)消毒20 min。用灭菌的细胞筛(50目)过滤种子;再用去离子水冲洗、过滤,反复4~6次,冲去表面残留的消毒液。将细胞筛(50目)上过滤的种子,用MS+2.0 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的种子萌发液体培养基冲洗到三角瓶内。25 ℃、100 r/min、黑暗培养15 d。
  2.2 种子生长成芽
  已萌发的种子经细胞筛(50目)滤去液体,将种子原球茎接种于MS+0.1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂、pH 5.8的诱导成芽固体培养基上,尽量分散种子,每皿100粒。25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养20-30 d。
  2.3 生根培养
  将生成的幼苗及增殖的幼苗接种到1/2 MS+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+0.5 g/L活性炭+6 g/L琼脂、pH 5.8的生根培养基里,每瓶25~30株,25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养30-40 d。
  2.4 炼苗移栽
  当白芨幼苗的根生长到3~5 cm长时,即可炼苗移栽,栽前先揭开瓶盖适应外界环境3-5 d。移栽时先用清水洗净根部琼脂,注意不要损伤根及原球茎结构;将健壮的白芨组培苗移栽到装有育苗基质的穴盘中,栽后浇透水,于炼苗棚中继续培养。管理上前期注意弱光保湿,第一周应加盖遮阳网保持弱光,并覆盖薄膜保湿;移栽15 d后白芨成苗即可生长正常,移栽30 d左右即可定植;定植后常规田间管理。
  3 成熟白芨种子离体培养
  3.1 种子表面灭菌及萌发
  将成熟的白芨蒴果(未开裂,含种子)用纱布包好,自来水流水冲洗30 min;在超净工作台上用75%乙醇进行表面消毒30 s,无菌水冲洗1~2次,用解剖刀及镊子小心剥开果实,将种子小心拨入无菌组培瓶中,加适量5%次氯酸钠溶液(滴加2~3滴吐温-20)消毒20 min。将细胞筛(50目)上过滤的种子用MS+0.5 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的种子萌发液体培养基冲洗到三角瓶内。25 ℃、100 r/min黑暗培养15 d,萌发率达99%。
  3.2 种子生长成芽
  已萌发的种子经细胞筛(50目)滤去液体,将种子原球茎接种于MS+0.5 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂、pH 5.8的诱导成芽固体培养基上,每皿100粒。25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养20-30 d。
  3.3 生根培养
  将长大的幼苗及增殖的幼苗接种到1/2 MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1.0 g/L活性炭+6 g/L琼脂、pH 5.8的生根培养基上,每瓶25~30株,25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养30-40 d。
  3.4 炼苗移栽
  当培养出的白芨幼苗根生长到3~5 cm长时,炼苗移栽,栽前先揭开瓶盖适应自然条件3-5 d。移栽先时用自来水洗净根部附着的琼脂,小心不要损伤根及原球茎结构;将健壮的白芨组培苗移栽到装有基质的育苗穴盘中,栽后浇透水,于炼苗棚中放置整齐,继续炼苗培养。管理上前期注意弱光保湿,第一周应加盖遮阳网保持弱光,并覆盖薄膜保湿;移栽15 d后白芨成苗即可生长正常,移栽30 d左右即可定植;定植后常规田间管理。
  4 小结
  采用近成熟的白芨种子进行液体悬浮培养,能显著提高种子萌发率,可达99%,并加快原球茎的生成速度(15 d左右)。且该技术操作简便,成本低廉,每瓶液体培养基可萌发数万粒种子,且种子萌发整齐,出苗一致,污染率低,结合简化的固体培养基培养,大大缩短了白芨组织培养周期,最快能在75~90 d内获得大量健壮的无菌苗用于移栽,实现了白芨组培苗的高效快速生产,并有效简化了操作程序,降低了生产成本,便于规模化生产。
  作者:熊丙全 廖相建 郑雪莲
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