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适宜的培养基制备方法将影响微生物试验结果
      
  制药企业生产车间、实验室洁净区的微生物污染与污染源密切相关,细菌、真菌、病毒性污染等较为常见,主要由洁净环境和设施管理不当、人员不规范的行为与交叉污染、操作菌株的泄露、原辅料混入、设备与容器污染等原因造成。因而选择一种可靠的洁净区微生物检测方法,可以有效监控洁净区的环境,控制微生物污染的风险,确保微生物监测结果的可靠性和准确性,体现洁净区环境微生物控制的真实水平。
  1、培养基
  培养基是微生物试验的基础,直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。
  在微生物检测时,我们应该高度重视所使用的培养基(包括购置不同批号的成品预装培养基、不同批次的脱水培养基干粉、按照处方使用不同批次的原材料自行配制培养基等)、制备程序(包括水质控制、配制方法、灭菌程序等)、贮藏条件(温湿度、时间及盛装培养基的容器条件等)等是否满足微生物检测用要求。
  无论是做洁净区沉降菌、浮游菌,还是表面微生物,所使用的培养基平皿在使用之前都必须对使用批次的培养基平皿做促生长试验,这也是培养基的性能试验,更是培养基的内在质量标准。它是用已知的标准菌株按照规程和标准测定培养基性能是否符合要求。
  在这个实验中,我们不能忽略的一个环节,就是需要使用对照培养基。关于对照培养基,在《中国药典》中借鉴欧美药典,引入培养基适用性检查以保障微生物限度检查结果的准确性和可靠性。
  但是,对于欧美药典中的“之前验证过的培养基”的采纳与否,存在很大争议,集中在两点。第一,我国药品微生物实验室小而分散,数以千计的企业和基层药检所难以有效地进行对照培养基的验证、评价工作;第二、在监督检查中,难以有效评估企业微生物实验室对对照培养基的验证情况,以统一的、经过充分评价和验证过的对照培养基进行培养基的适用性试验。
  所以我们在使用对照培养基过程中,应该注意:
  在保证配制和灭菌过程无误的条件下,对照培养基可以不经适用性实验检查直接用于样品检查。
  不同处方培养基的替代使用不能通过培养基适用性试验简单确定,要按标准规定使用培养基。
  不建议使用经过对照培养基进行适用性试验检查合格的其它培养基作为实验室自用的“对照培养基”。
  如果没有特殊规定,培养基配制采用蒸馏水或纯化水均可,但应进行检测控制。
  干粉培养基或培养基原料变质不应再用;成品培养基储存过程发现变色、长菌、严重脱水等也不应再用。
  2、洁净区微生物检测
  制药企业在评估生产洁净环境的微生物状况时,需对洁净环境进行动态或静态监测,使用沉降菌平皿、空气浮游菌平皿和表面接触皿对洁净区微生物检测。其中浮游菌和沉降菌的检测根据GB16293-2010《医药工业洁净室(区)浮游菌的测试方法》和GB16294-2010《医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法》规定进行检测。表面微生物检测方法有擦拭法和表面接触碟法。
  2.1沉降菌取样
  沉降菌检测方法采用沉降法,即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿,经过若干时间,在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数,以平板培养基皿中的菌落数来判断结晶环境内活微生物数,并以此来评定洁净区的洁净度。
  取样方法:环境监控人员用消毒剂消毒双手,取出TSA平皿,按照采样点布置图逐个放置,然后从里到外逐个打开培养皿盖,并将盖内侧向下放在培养皿底座旁边,使培养基表面暴露在空气中。为了避免污染培养基表面,手和手臂不要经过已开盖的培养皿上方。
  2.2浮游菌取样
  浮游菌取样是通过空气采样仪收集悬浮在空气中的生物性粒子于专门的培养基,经若干时间和适宜的生长条件让其繁殖到可见的菌落并计数,以判定该洁净区的微生物浓度。
  浮游菌采样器一般采用撞击法机理,可分为狭缝式采样器、离心式或针孔式采样器。
  狭缝式采样器由内部风机将气流吸入,通过采样器的狭缝式平板,将采集的空气喷射并撞击到缓慢旋转的平板培养基表面上,附着的活微生物粒子经培养后形成菌落。
  离心式采样器由于内部风机高速旋转,气流从采样器前部吸入从后部流出,在离心力的作用下,空气中的活微生物粒子有足够的时间撞击到专用的固形培养条上,附着的活微生物粒子经培养后形成菌落。
  针孔式采样器是气流通过一个金属盖吸入,盖子上是密集的经过机械加工的特制小孔,通过风机收集到细小的空气流直接撞击到平板培养基表面上,附着的活微生物粒子经培养后形成菌落。
  目前大部分制药企业采用针孔式采样器进行浮游菌采样,故介绍一下其取样方法。
  取样方法(针孔式采样器):
  环境监控人员应首先确定空气采样器在校验合格的范围内;
  采样前,用经消毒剂浸湿的无菌布擦拭空气采样器的外表面,并让其自然挥干;
  准备好一个已灭菌好的采样器盖子,灭菌后的采样盖子仅能使用一次;
  环境监控人员用消毒剂消毒双手,取出TSA平皿,将培养皿正置于顶部的支撑面上,将盖子打开放置在一边,打开消毒袋,取出多孔采集盖,盖到采样器上,开始采集空气样品;
  每个取样点,用一块TSA培养基平皿,取样量1000升;
  取样结束后,在培养基平皿上标示相关信息,如房间号、检测项目、级别及班次、取样日期等。
  注意:在采样过程中,不要将任何物体(包括操作人员的手和头)置于培养基平皿上方,避免在取样点附近活动。
  2.3表面微生物取样
  表面微生物的取样有两种方法,即擦拭法和表面接触碟法。
  擦拭法是一种常用的表面微生物取样方法,在没有表面接触平皿法之前,洁净区表面微生物取样几乎都采用这种方法,常用于设备表面取样,优点是能对弯曲表面直接取样。通过考察有代表性部位的微生物水平评价设备污染状况,另外还常用于设备的清洁验证中。但擦拭取样法有其局限性,它的微生物回收率通常受取样工具、溶解溶剂、取样人员、检测方法等因素的影响。
  具体操作方法:将棉签按在取样表面上,用力使其弯曲,平稳而缓慢的擦拭取样表面,在向前移动的同时将其从一边移动到另一边。擦拭过程应覆盖整个表面,翻转棉签,让棉签的另一面也进行擦拭,但与前次擦拭移动方向垂直,至少需擦拭25cm2的区域。
  表面接触碟法是在擦拭法的基础上发展起来的,采用直径为55mm的接触皿对被取样表面进行接触取样。平皿应装满一种体积可控的琼脂培养基(根据目标微生物选择),为表面采样特制。琼脂应在培养皿上形成凸起弯月面,即检测人员打开平皿后,用培养基表面轻轻接触取样点表面,注意不要旋转,取样完毕后立即盖上平皿盖,完全接触过程大约5s,取样结束后用消毒剂浸湿的无菌洁净布擦拭取样点。
  3、注意事项
  对于单向流洁净区或送风口,采样器采样口朝向应正对气流方向;对非单向流洁净区,采样口向上。
  布置采样点时,至少应尽量避开尘粒较集中的回风口。
  采样时,环境监控人员应站在采样口的下风侧,并尽量少动。
  应采取一切措施防止采样过程的污染和其他可能对样品的污染。
  培养皿在用于检测时,为避免培养皿运输或搬动过程造成的影响,宜同时进行阴性对照试验,每次或每个区域取一个对照皿,与采样皿同法操作,但不需暴露采样,然后与采样后的培养皿(TSA、SDA)一起放入培养箱内培养,结果应无菌落生长。
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